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分光光度計的原理及應用

更新時間:2010-07-07 點擊量:4740
  分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。該儀器是食品廠、飲用水廠辦理QS、HACCP認證的*檢驗設備。
  分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。儀器分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。
  分光光度計計采用一個可以產生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

核酸的定量
  核酸的定量是分光光度計使用頻率zui高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應的系數。如:1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經過上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實驗并非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。
事實上,分光光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內變化,即分光光度計有一定的準確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值在0.1-1.。在此范圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計的測試范圍)。zui后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無

   分光光度計的特點:
         采用微機控制并進行數據處理。
 
  □用干涉濾光片作為分光元件,光電管進行光電轉換。
 
  □具有鉀、鈉濃度直讀,曲線擬合,靈敏度漂移,自動校正,自動調滿度。火焰能量指示,操作失誤顯示,打印結果等功能。
 
  □線性穩定性、重現性好,尤其適合臨床應用。

    分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。該儀器是食品廠、飲用水廠辦理QS、HACCP認證的*檢驗設備。
     分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。儀器分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。
      分光光度計計采用一個可以產生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率zui高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應的系數。如:1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經過上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實驗并非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。
事實上,分光光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內變化,即分光光度計有一定的準確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值在0.1-1.。在此范圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計的測試范圍)。zui后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無

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